000112

Перспективными направлениями конфокальной микроскопии являются г ^ методики FRAP - Fluorescence Recovery After Photobleaching («Восстанов­ ление флуоресценции после фотовыжигания») и FRET - Fluorescence Resonance Energy Transfer («Передача энергии посредством флуоресцентного резонанса»). FRAP применяется для исследования подвижности молекул посредством фотохимического разложения (выжигания) флуорохрома в определённой обла­ сти (несколько квадратных микрометров) клетки. В эту область подаётся лазерный луч высокой интенсивности, разрушающий флуорохром или вызы­ вающий его отсоединение от молекулы. Окраска в данной точке исчезает1. Вследствие диффузии молекул в клетке флуоресценция должна восстано­ виться. Время восстановления окраски - показатель подвижности молекул. FRET применяется для определения расстояния между молекулами разных типов, анализа их окружения и взаимодействий. Молекулы метятся двумя флуорохромами (донором и акцептором). Спектр испускания донора пере­ крывается со спектром поглощения акцептора. Энергия от донора к акцеп­ тору передаётся на малых расстояниях (несколько нм) в результате резо­ нанса между энергетическими уровнями. Вероятность резонанса зависит от расстояния между молекулами. Затем акцептор излучает энергию в видимой области спектра, которая регистрируется конфокальным микроскопом. Предел разрешающей способности светового микроскопа был практически достигнут к концу XIX в. В 1886 году К. Цейс сконстру­ ировал микроскоп, разрешение оптической системы которого было близко к расчетному пределу. Новые возможности в изучении струк­ туры клеток были созданы электронной микроскопией. В начале XX в. физикам удалось определить двойственную природу элек- > • трона - оказалось, что эта частица обладает и волновыми свойствами. Были изобретены магнитные линзы, при помощи которых можно фокуси­ ровать электронный луч. В 1931 г. немецкие инженеры Э. Руска2 и М. Кнолль сконструировали и по­ строили первый трансмиссионный (просвечивающий) электронный микро­ скоп, а в 1938 г. фон Ардене создал сканирующий электронный микроскоп. Первые трансмиссионные микроскопы для массового применения стала про­ изводить фирма «Сименс»3 в 1939 г. 1 Этот метод иногда называют «фотоотбеливание». 2 Эрнст Руска стал лауреатом Нобелевской премии по физике в 1986 г. 3 Сейчас фирма «Сименс» известна как производитель электроники и медицинских приборов. 2.3. ЭЛЕКТРОННАЯ МИКРОСКОПИЯ 15