000112

2.4. ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЕ ЦЕНТРИФУГИРОВАНИЕ В 1919 г. шведский учёный Т. Сведберг разработал метод ультра­ центрифугирования для выделения коллоидных частиц из растворов. В 1923 г. он построил первую аналитическую центрифугу - прибор, : - позволяющий вращать объект с огромной скоростью. При этом создаётся ускорение, многократно превышающее ускорение свободного па­ дения (g). Первоначально такие центрифуги использовали для определения молекулярной массы белков (например, Сведберг выяснил, что молекулярная масса гемоглобина - 68 kDa). В 1938 г. Беренс использовал центрифугу для ра з­ деления ядер и цитоплазмы клеток печени, а в 50-х годах А. Клод усовершен­ ствовал метод ультрацентрифугирования, и в его лаборатории начались полномасштабные исследования клеточных структур, полученных путём разделения в ультрацентрифуге1. Для центрифугирования готовят гомогенат клеток - при пониженной температуре, в среде с определённым pH клетки растирают в специ­ альной ступке, продавливают через мельчайшие отверстия либо обра­ батывают ультразвуком. Для растительных и грибных клеток приме­ няют более жёсткие воздействия, чтобы разрушить клеточные стенки. Гомогенат центрифугируют с низкой скоростью (создавая ускоре­ ние до 1000 g), при этом оседают крупные частицы - неразрушенные клетки и ядра. Надосадочную жидкость переносят в другую пробирку и центри­ фугируют со средней скоростью (ускорение 20000 g). Это приводит к осаждению митохондрий, лизосом и пероксисом. Надосадок центрифугируют с высокой скоростью (ускорение 80000 g). Оседают микросомы (в основном это фрагменты ЭПС2). Для выделения рибосом, вирусных частиц и макромолекул центри­ фугирование продолжают при ускорении до 300000 g3 (см. рис. 4). Оседание частиц при ультрацентрифугировании зависит от их массы , - и плотности, и характеризуется коэффициентом седиментации - он из­ меряется в Сведбергах (S). Один Сведберг составляет 10-13с. Например, для ли­ зосом S=9400, для рибосом прокариот S=70, а для эукариотических рибосом S=80. 1 В 1926 году Т. Сведберг удостоен Нобелевской премии; А. Клод и К. Де Дюв получили эту награду в 1974 г. за исследование клеточных структур. 2 Обратите внимание на то, что мембраны ЭПС при дифференциальном центрифугировании замыкаются в сферы и образуют пузырьки-микросомы. 3 На каждом этапе время центрифугирования увеличивают от 10 минут (1000 g) до 2-х часов (300000 g). 19