441

19 2.4. ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЕ ЦЕНТРИФУГИРОВАНИЕ В 1919 г. шведский учёный Т. Сведберг разработал метод ультра- центрифугирования для выделения коллоидных частиц из растворов. В 1923 г. он построил первую аналитическую центрифугу – прибор, позволяющий вращать объект с огромной скоростью. При этом создаётся ускорение, многократно превышающее ускорение свободного па- дения (g). Первоначально такие центрифуги использовали для определения молекулярной массы белков (например, Сведберг выяснил, что молекулярная масса гемоглобина – 68 kDa). В 1938 г. Беренс использовал центрифугу для раз- деления ядер и цитоплазмы клеток печени, а в 50-х годах А. Клод усовершен- ствовал метод ультрацентрифугирования, и в его лаборатории начались полномасштабные исследования клеточных структур, полученных путём разделения в ультрацентрифуге 1 . Для центрифугирования готовят гомогенат клеток – при пониженной температуре, в среде с определённым pH клетки растирают в специ- альной ступке, продавливают через мельчайшие отверстия либо обра- батывают ультразвуком. Для растительных и грибных клеток приме- няют более жёсткие воздействия, чтобы разрушить клеточные стенки. Гомогенат центрифугируют с низкой скоростью (создавая ускоре- ние до 1000 g ), при этом оседают крупные частицы – неразрушенные клетки и ядра. Надосадочную жидкость переносят в другую пробирку и центри- фугируют со средней скоростью (ускорение 20000 g ). Это приводит к осаждению митохондрий, лизосом и пероксисом. Надосадок центрифугируют с высокой скоростью (ускорение 80000 g ). Оседают микросомы (в основном это фрагменты ЭПС 2 ). Для выделения рибосом, вирусных частиц и макромолекул центри- фугирование продолжают при ускорении до 300000 g 3 (см. рис. 4). Оседание частиц при ультрацентрифугировании зависит от их массы и плотности, и характеризуется коэффициентом седиментации – он из- меряется в Сведбергах (S). Один Сведберг составляет 10 -13 с. Например, для ли- зосом S=9400, для рибосом прокариот S=70, а для эукариотических рибосом S=80. 1 В 1926 году Т. Сведберг удостоен Нобелевской премии; А. Клод и К. Де Дюв получили эту награду в 1974 г. за исследование клеточных структур. 2 Обратите внимание на то, что мембраны ЭПС при дифференциальном центрифугировании замыкаются в сферы и образуют пузырьки-микросомы. 3 На каждом этапе время центрифугирования увеличивают от 10 минут (1000 g ) до 2-х часов (300000 g ).